如何用SAPTRAP荧光标记内源性基因？带你了解

本文摘要：自50多年前发觉GFP以后，荧光蛋白(FPs)的光谱不断生长发育，现阶段已变成研究细胞系统组织作用的关键*用工具。FPs已被用以追踪蛋白质定位、细胞构造、细胞内输送、蛋白周转率等。除此之外，根据设计方···

　　自50多年前发觉GFP以后，荧光蛋白(FPs)的光谱不断生长发育，现阶段已变成研究细胞系统组织作用的关键*用工具。FPs已被用以追踪蛋白质定位、细胞构造、细胞内输送、蛋白周转率等。除此之外，根据设计方案与细胞器有关的FP整合，科学研究者早已可以科学研究很多细胞工艺流程，包含有丝分裂、线粒体分裂/整合、进核和神经元传送等。虽然FPs已经可以运用于科学研究很多细胞机制，但应用FPs还有一些局限性。荧光标记蛋白的过多表述可造成蛋白质定位不正确、聚集、作用被毁坏，*后误导蛋白质的细胞功能。

　　一种避免荧光蛋白过度表达的方法是用荧光蛋白取代基因副本。CRISPR基因组编辑有助于实现这一目标。该系统的作用是，内部酶Cas9可以在GRNA序列指定的基因组点上产生DNA双链断裂(DSB)。研究人员可以在DSB处插入特定的DNA序列(如GFP)，通过设计GRNAS来诱导特定基因组点的断裂，并使用同源定向修复方法。CRISPR可以使研究人员标记目标内源性基因，从而更好地理解正常的蛋白质功能。

　　CRISPR蛋白标签确实有其局限性，尤其是尝试做高通量实验时。如果研究人员想做高通量基因筛查，单独生成GRNAS和同源手臂修复模板，含有每次插入标志，费钱又费时。另外，对含有新标志基因的转基因菌种进行筛查也是一个挑战，大部分插入只能通过PCR这样的工艺或者视表型来检测。

　　C.elegans荧光蛋白标签的SapTrap改进。

　　Jorgensensensen实验室*近**了一种模块化质粒组装工具，称为Saptrap，用于改善C.elengansCRI基因组标记。Saptrap为研究人员生成高通量靶向载体提供了一种方便的构建方法。这些载体可以用来标记内源基因，并引入选择标记来筛选改良的菌株。在使用Saptrap时，研究人员首先需要设计所需的grna靶序列和5和3同源臂修复模板(图1，步骤1)。不需要PCR或克隆，因为在使用Sapi消化目的载体后，会产生2个位点-**个位点，接收sgra靶序列，用于U6启动子表达，第二个位点接收同源臂修复模板。

　　saptrap包含一个预建的供体质粒物库，包含好几种类型的荧光(EGFP、tagRFP、mcerry)和非荧光(halo、snap)标识，一个可选用的标识(floxedcbr--unc-1119)，用以筛选插入事件，及其各种各样联接模块(标识和同源臂中间的联接序列)。用sapi消化设备供体质粒能够释放标识，挑选标识和联接器(下图，第2-3步)。因为同一类型的供体质粒能产生与众不同的sapi5'悬垂，因此能够应用文库的不同联接器和标识供体质粒组成搭建作用独特的修补模版。*后将拼装恰当的靶向性质(下图，第4步)和cas9表示质粒共同注入，将必须的基因遗传标识和标识序列插入到靶向位点。挑选标识能够根据cre介导的切除开展无痕标识插入。

　　除了Saptrap在标记单个基因位点方面的明显优势外，该工具还提供了一个修复模板，以组织特定方式标记蛋白质，以及在多个目标位点插入标记的三位点目标的载体。Saptrap载体可以很容易地修改，从而标记数百个基因，然后生成一个强大的基因筛选库。

　　其它蛋白标签系统。

　　对于不使用C.elegans的人来说，为了帮助标记其他模式生物(包括哺乳动物细胞)中的基因组位点，有几个研究小组设计了模块化工具。

　　人类细胞内源性基因的C端标签融合内源性基因的CRISPaint(CRISPr-asssistesagging-ssist)。用户需要3个载体才能使用CRISPaint：

　　1)gRNA载体的靶向目标基因。

　　二是指定质粒插入位点。

　　3)作为通用供体质粒获得的包含所需标签的载体。

　　CRISPaint工具包括荧光素酶(NanoLuc)、荧光蛋白(TagGFP,TagBFP,TagRFP,TagRFP和T2A-TurboGFP-PEST)和小表位标记等几种用于蛋白标记的供体质粒子，

　　AviTag，HaloTag，SpyTag，Myc，StreptagII。

　　Foersteman实验室**了一种根据聚合酶链反应(PCR)的系统软件，容许客户产生含有所需GRNA和U6启动子立即融合的质粒，及其含有同源臂和N端或C端标签的第二个质粒。随后将2个PCR反应混和与Cas9表达载体一起转染。她们能够立即导入稳定表达Cas9的飞蝇S2细胞系统。该PCR工具具有C-和N-端标志载体(如GFP、Flag、YFP、Step、TEV-V5)，可挑选应用Blasten或Purcin开展筛选。

　　AllisitusforCellscience的研究人员近期**了一组荧光标示哺乳动物细胞的细胞结构的质粒。这些质粒在CRISPR/Cas9诱导断裂后，使用荧光蛋白进行同源定向修复，其两侧有与相关基因同源的长区域。

　　除了对蛋白质定位和活性进行简单监控外，还可以对CRISPR标记系统进行修改，分析附加蛋白质特征。例如，MasatoKaneMaki实验室**了一种基于CRISPR/Cas的系统，用于标记内源性蛋白质的生长素诱导去铁素(AID)标记，以便在向培养基添加生长素后产生可快速、可逆的蛋白质。可将包括蛋白增强子和**子在内的任何数量的调节序列纳入修复模板，以诱导蛋白质表达水平的变化。

　　CRISPR标记系统为研究人员提供了简单有效的标记内源性蛋白的方法，可以用来研究蛋白质表达，定位和蛋白-蛋白相互作用。此外，研究人员可以生成一个全基因组文库，其中含有内源性位点荧光标记蛋白，以揭示以前未知的蛋白质功能，因为SapTrap等标记系统中包含的载体模块化排列。

参考文献

1. Schwartz, Matthew L. and Eric M. Jorgensen. “SapTrap, a T oolkit for High-Throughput CRISPR/Cas9 Gene Modification in Caenorhabditis elegans.” Genetics. 202(4) (2016):1277-88. PubMed PMID: 26837755. PubMed Central PMCID: PMC4905529.

2. Schmid-Burgk, Jonathan L., et al. “CRISPaint allows modular base-specific gene tagging using a ligase-4-dependent mechanism.” Nat Commun. 7 (2016):12338. PubMed PMID: 27465542. PubMed Central PMCID: PMC4974478.

3. Natsume, T oyoaki, et al. “Rapid Protein Depletion in Human Cells by Auxin-Inducible Degron T agging with Short Homology Donors.” Cell Rep.15(1) (2016):210-8. PubMed PMID: 27052166.

4. Kunzelmann, Stefan, et al. “A Comprehensive T oolbox for Genome Editing in Cultured Drosophila melanogaster Cells.” G3 (Bethesda) 6(6) (2016):1777-85. PubMed PMID: 27172193. PubMed Central PMCID: PMC4889673.

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