荧光素偶联抗体标记的两种标记方法

本文摘要：荧光素偶联抗体标记样品细胞标记荧光素偶联抗体的方法相对简单。只需在样品单细胞悬浮液中加入适量荧光素偶联抗体，在4℃下完全混合，静置30min，然后用PBS冲洗游离抗体。流式PBS重悬细胞后，可进行样品···

　　荧光素偶联抗体标记

　　样品细胞标记荧光素偶联抗体的方法相对简单。只需在样品单细胞悬浮液中加入适量荧光素偶联抗体，在4℃下完全混合，静置30min，然后用PBS冲洗游离抗体。流式PBS重悬细胞后，可进行样品分析。

　　当标记荧光素偶联抗体时，样品细胞的体积可以适当减少，以节省抗体。流式分析所需的样品细胞数量较少，5×10到1×10的6个方细胞就足够了，所以样品细胞的体积一般可以是10-100ul，如果目标细胞的比例不是很低，10ul就足够了。

　　因为在流动标记中，样品细胞上的所有抗原分子都可以与荧光素偶联抗体结合，只要样品细胞中的荧光素偶联抗体达到一定浓度，荧光素偶联抗体相对过剩。

　　因此，每个样品细胞的体积越小，每个需要添加的荧光素偶联抗体的数量就越少，这可以节省抗体，从而节省实验成本。流式分选时，样品细胞的数量越多，样品细胞的体积就会相应增加。当然，其原则是在保证标记质量的前提下，尽量减少样品细胞的体积，从而节省荧光素偶联抗体。

　　荧光素偶联抗体标记主要有直接标记法和间接标记法两种方法，如图所示。

　　直接标记法是用荧光素偶联抗体直接标记样品细胞。抗体直接与样品细胞上的抗原分子结合，直接与抗体偶联的荧光素作为指示剂间接反映样品细胞表达相应抗原分子的情况。直接标记法只需一步标记即可。该方法简单，非特异性染色少。它是一种常用的标记方法，如图所示。

　　间接标记法由两步标记组成。**步是用生物素(biotin)偶联抗体标记样品细胞，第二步是用荧光素偶联链霉菌亲和素(streptavidin、SA)标记样品细胞，如图所示。

　　间接标记法采用生物素-亲和素系统，是20世纪70年代末发展起来的生物反应放大系统。1分子亲和素可以与4分子生物素结合。虽然生物素和亲和素的结合不是抗原-抗体的结合，但它们的结合特异性、敏感性和结合力并不弱于抗原抗体的结合，广泛应用于生物学中。SA是一种与亲和素相似的蛋白质，因从链霉菌中提取而得名。SA等电点低于亲和素，不含糖基链，因此在检测中的灵敏度和特异性高于亲和素。

　　间接标记法通常用于多通道分析，以减少荧光素偶联抗体的类型。例如，在分析4色(FTC、PE、Percp、APC)时，实验需要分析另一种表面抗原分子(如CTLA-4)，但实验室没有荧光素偶联抗CTLA-4单抗，需要购买，根据其他现有抗体和实验要求可能需要FTC偶联抗CTLA-4单抗、PE偶联抗CTLA-4单抗、Percp偶联抗CTLA-4单抗、APC偶联抗CTLA-4单抗。在这种情况下，如果实验室有SA-FITC、SA-PE、SA-Percp和SA-APC(间接标记法第二步标记的荧光素偶联SA是通用的)，则只需购买生物素偶联CTLA-4这种抗体。此时，间接标记法可以实现1种抗体的购买。

　　同样，如果实验要求检测样品细胞CD25抗原分子的表达，而分配给CD25的荧光通道不确定，则只需购买生物素偶联抗CD25单抗1抗体应用间接标记法即可满足实验要求;如果采用直接标记法，则需要同时购买FITC偶联抗CD25单抗、PE偶联抗CD25单抗、Percp偶联抗CD25单抗、APC偶联抗CD25单抗。

　　然而，当单色分析、多色分析不需要相互通道匹配，或相应荧光素偶联抗体的通道分配非常准确时，尽量使用直接标记法，因为直接标记法简单，只需要一步标记，结果清晰。直接标记法和间接标记法见表。

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