细胞免疫荧光标记的染色原理及常见问题有哪些？

本文摘要：一.实验原理。细胞免疫化学和免疫组织化学实验都是根据抗原抗体反应和化学显色的原理，运用标示的特异性抗体对组织或细胞内抗原的分布开展原位检测技术性。细胞免疫化学将培养处理后的细胞爬行片.固定不动.破膜.···

　　一.实验原理。

　　细胞免疫化学和免疫组织化学实验都是根据抗原抗体反应和化学显色的原理，运用标示的特异性抗体对组织或细胞内抗原的分布开展原位检测技术性。细胞免疫化学将培养处理后的细胞爬行片.固定不动.破膜.关闭后，添加一抗与抗原蛋白结合，再添加标示有荧光素的二抗与一抗反应，*后通过激光共焦扫描显微镜来显示细胞中靶蛋白的表达变化和定位。

　　激光器共焦扫描显微镜是目前*先进的细胞生物医学分析仪器之一，使用激光作为扫描光源，逐点.逐面.快速扫描成像，扫描的激光和荧光收集共用一个物体镜，物体镜的焦点即扫描激光器的焦点，也是瞬时成像的物体点。从一个点光源发射的探测光通过透镜对被观测物体进行聚焦，如果物体刚好在聚焦上，那么通过原来的透镜将反射光汇聚回光源，这就是所谓的共焦。由于激光束的波长较短，光束非常细，共焦激光扫描显微镜具有很高的分辨率，大约是普通光学显微镜的3倍。系统对焦后，扫描限制在样品的平面内。当对焦深度不同时，可以得到不同深度层次的样品图像。这些图像信息存储在计算机中，通过计算机分析和模拟，可以显示样品的三维结构。

　　二.技术应用。

　　内分泌激素.蛋白质.多肽.神经递质.受体.细胞因子.细胞表面抗原.肿*标志物。

　　三.实验问题。

　　1.背景荧光信号很高?

　　a.一抗质量差。

　　选择具有较高特异性和效价的抗体。

　　c.抗体浓度过高。

　　d.一抗和二抗的稀释比例注意调整。

　　e.不完全封闭。

　　f.封闭式条件的改善。

　　g.不足够的洗涤。

　　2.荧光信号弱?

　　a.表达能力过低的目的蛋白质。

　　b.可对照设置阳性细胞，表达量较高。

　　c.细胞破膜效果差。

　　d.使用合适的透气剂或不透气的甲醇固定。

　　e.一抗稀释过多。

　　需要对一抗稀释比例进行预实验摸索。

　　g.选择错误的二抗。

　　h.二抗，可以正确识别一抗。

　　四.FQA常见问题。

　　Q：细胞免疫荧光检测常用荧光染料有哪些?

　　1.异硫氰酸(Fluoresceinlsotiocyanat,FITC)

　　nm490~495。

　　呈翠绿色荧光520~530nm。

　　2.四甲基异硫氰酸罗丹明(TetramethyRRITC)

　　橙红色荧光620nm。

　　3.RB200RB200)四乙

　　呈橙红色荧光，595~600nm。

　　4.TexasRedexasRed)

　　红色荧光620nm。

　　5.CY3。

　　呈鲜红色荧光的568-574nm。

　　6.碘化丙啶(PI)

　　红色荧光630nm。

　　7.4’，6-e二啶基-2-苯基吲哚(6-diamino-2-phenylindole)

　　蓝色荧光461nm。

　　问：二抗标记的荧光如何选择?

　　答：二抗标记的荧光色的选择非常重要。在实验之前，实验方案需要根据现有材料和仪器的局限性进行设计。一般来说，我们标记三种颜色。目前，PI(红色)或DAPI(蓝色)是细胞核染料中常用的颜色。如果EGFP(绿色)在细胞中也被表达出来，则需要选择其他颜色的荧光素来标记目的蛋白质。在必要时，应使用相似的颜色，并且图片应在后期使用光谱分离技术进行处理(需要*业人员进行，不建议使用相似的颜色)。

　　问：细胞免疫化学爬片使用的固定剂如何选择?

　　使用甲醇，强脱水性变性蛋白质，并能溶解脂类物质产生渗透作用;蛋白质变性完全，对抗原体的保存性能良好，抗原体可以完全暴露，细胞形态不易保存，细胞可能扁平。

　　细胞结构抗原.酶抗原交联剂使用多聚甲醛，使细胞内分子相互连接成网状结构，并保持在原位，更容易维持细胞的结构交联产生的障碍可能会减少细胞成分的抗原能力，需要对细胞膜相关成分蛋白进行通透处理。

　　问：有多少抗体适合制造细胞免疫荧光?

　　答：对于细胞免疫荧光实验，我们需要使用普通荧光显微镜进行预实验，然后在确认实验条件后进行正式的Confocal实验。在确认实验条件后，我们可以进行正式的Confocal实验。当24孔板的细胞攀爬片在一个抗体37℃孵化时，通常会添加200ul通过BSA稀释的一个抗体，其稀释倍数需要参考抗体说明。如果稀释倍数为1:100，则每个攀爬片需要2ul(细胞免疫荧光的一个抗稀释倍数小于WB)。请注意，提供的抗体量应满足预实验和正式实验所需的量。

　　问：除了用于细胞免疫荧光拍摄外，激光共聚胶显微镜拍摄还能进行什么检测?

　　答：Confocal实验也可以用来进行细胞内游离钙.线粒体膜电位.活性氧.细胞膜流动性.细胞结构等实验结果的拍摄和分析工作，因为各种荧光标记探头的应用，通过对荧光探头分布和荧光强度的分析客户对细胞处理的要求，并购买合适的探头试剂盒，我们还可以为您进行实验所需的Confocal拍摄工作。

　　五.荧光染色三种细胞免疫试验步骤。

　　免疫荧光A.zo-1，步骤如下：

　　1.从孵化箱中取出，当细胞在盖片上生长融合到95%-100%。

　　2.每次洗10分钟，用预温的1×PBS洗3次。

　　3.4%室温固定20-30分钟。

　　4.1×每次10分钟洗3次PBS。

　　TritonX-100透化2-5分钟5.0.2%。

　　6.1×每次10分钟洗3次PBS。

　　室温封闭7.5%BSA30分钟。

　　8.在湿箱中加一抗(用1%BSA稀释)，4度过夜。

　　9.1×PBS每次洗10分钟3次。

　　10.加二抗30分钟闭光(用1%BSA稀释)。

　　11.1×PBS每次洗10分钟3次。

　　甘油封12.95%。

　　注意：用1×PBS稀释4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA。

　　B.免疫荧光细胞爬片的步骤基本相同：

　　1.在35mm或60mm用过的细胞培养皿中取出细胞爬片，用PBS洗三遍。

　　注意：有时细胞攀爬片可能相对较小，所以在夹紧时要小心。注意正面。把它们放在盘子里清洗更方便，以避免来回夹紧。此外，在清洗过程中添加PBS时，不要冲洗太多，也不要冲洗细胞。当我清洗它时，我会添加更多的PBS。如果我摇动它，它会在5分钟或10分钟内倒出。

　　PBS洗三次，2.4%冷固定20分钟。

　　TritonX-100通透10分钟3.0.2%PBS洗三遍。

　　4.血清封闭30分钟，与二抗相同，洗三次PBS。

　　5.感觉前者效果好，PBS洗三次，一抗4度湿盒内过夜，也可以37度2小时。

　　6.二抗室温2小时(避光)，或37度1半小时，PBS洗三次。

　　7.在直接照射荧光片之前，**使用DAPI染核。

　　8.蒸馏水洗掉PBS、甘油密封件和指甲油密封件周围。因为甘油不像树脂那样干燥，如果不使用指甲油密封件，它会一团糟。

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