细胞荧光标记技术详解：小分子荧光染料、免疫荧光标记、荧光蛋白技术

本文摘要：“随着显微成像技术的发展，人类逐渐观察的尺度逐渐减小，观测尺寸达到纳米级。荧光标记技术作为一种无损标记技术，为细胞可视化提供了重要的技术支持。通过靶向型荧光标记技术对细胞内的兴趣蛋白(Protein ···

　　“随着显微成像技术的发展，人类逐渐观察的尺度逐渐减小，观测尺寸达到纳米级。荧光标记技术作为一种无损标记技术，为细胞可视化提供了重要的技术支持。通过靶向型荧光标记技术对细胞内的兴趣蛋白(Protein Of Interest，POI)或亚细胞器进行荧光标记为研究蛋白或亚细胞器相关性质及功能提供了强有力的工具。”

　　小分子荧光染料

　　化学合成的有机小分子荧光染料具有结构、光谱、性质、功能的丰富多样性，在生物学与医学领域中获得广泛的应用。大量的商业化小分子靶向荧光染料被广泛应用于亚细胞器荧光标记。该类染料覆盖了从450 nm到700 nm的范围，主要以荧光素类染料、香豆素类染料、BODIPY类染料、罗丹明类染料、花菁类染料为主，通过自身分子性质或共价连接靶向型基团实现对目标靶向的定位。小分子荧光染料由于合成的简易性、通用性等优势获得了广大细胞生物学研究者的认可，但是该类分子对于特异性蛋白或受损的亚细胞器结构的标记并不理想，这一缺陷极大的限制了该类标记染料的应用空间。

　　免疫荧光标记

　　免疫荧光标记技术(immunofluorescence technique)是根据抗原与抗体特异性反应的原理，先将已知的抗原或抗体通过共价反应标记小分子荧光染料如荧光素、罗丹明、ATTO、Cy等，再用上述抗原或抗体对细胞或组织内的目标抗体或抗原进行标记，实现对目标蛋白或位置的可视化标记。由于抗原与抗体的结合具有特异性，免疫荧光标记技术具有极强的特异性。同时，小分子荧光染料通过NHS、异硫氰酸等高活性基团结合到抗体上，荧光标记的抗体具有与小分子荧光染料特有的广泛的光谱范围，对于实现细胞的多色标记具有重要的意义。然而抗原或抗体作为蛋白质很难通过细胞膜，免疫荧光标记技术只能对固定细胞或细胞膜外侧进行标记，对于活细胞动态变化、标记物运动状态等信息不能捕获。

　　荧光蛋白技术

　　1962年日本科学家下村修等人在水母中发现了绿色荧光蛋白(GFP, greenfluorescent protein)，自此开启了荧光蛋白标记技术的元年。通过解析破译绿色荧光蛋白的基因序列，将其利用基因工程技术引入兴趣蛋白中，实现对目标蛋白的可视化高动态研究。正是由于荧光蛋白在生命科学领域的重要应用，2008年日本学者下村修、美国科学家马丁-查尔菲以及美籍华裔科学家钱永健分享了该年的诺贝尔化学奖。随着科研人员的深入研究，多色种荧光蛋白的基因序列被发现并被广泛的应用于生物体内可视化研究中。尽管荧光蛋白标记技术被广泛的应用于生物成像领域，但是由于其自身结构与原理的限制，导致其存在应用周期较长、使用步骤复杂、自身光谱过宽或过窄、光稳定性差等缺陷。由于荧光蛋白有上述的缺陷致使其难以突破应用壁垒，对于高活性环境、长时间追踪、多色标记等领域存在困难。

　　融合蛋白标签+化学小分子染料

　　化学合成有机小分子荧光染料的结构、光谱、性质、功能丰富多样，在生物学与医学领域中已获得非常广泛的应用，但是大多数小分子荧光染料并不具备靶向特异性标记蛋白质的能力。如果可以实现小分子染料对蛋白质的特异性标记，必定可以弥补荧光蛋白在蛋白质标记研究中的部分局限性。目前，多种蛋白质特异性荧光小分子标记技术的发展实现了这一构想。这类技术仍是通过分子生物学手段构建靶标蛋白与多肽或蛋白标签的融合表达，利用多肽或蛋白标签与相应荧光底物或配体的特异性高效识别间接实现靶标蛋白的特异性标记。这些蛋白质特异性荧光小分子标记技术凭借标记的灵活性、底物或配体结构与功能的多样性以及较高的特异性和标记稳定性获得迅速发展，在活细胞内蛋白质功能等的实时、动态研究中获得越来越广泛的应用。

　　自二十世纪九十年代，绿色荧光蛋白( Green fluorescent protein， GFP)在细胞生物学领域获得突破性应用，近年来基因编码蛋白质特异性荧光小分子标记新方法也不断发展。为现代生命科学和医学领域的研究提供了丰富而强有力的工具。目前，已广泛应用的蛋白质特异性荧光小分子标记方法主要有：双砷-四半胱氨酸体系，SNAP/CLIP-tag， HaloTag， ACP-tag， PYP-tag， TMP-tag等。

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