细胞荧光标记选择指南，免疫荧光单标记和双标记的方法介绍

本文摘要：一、荧光标记选择指南。流式检测的**步是选择哪种方法，通常是用荧光物质标记的抗体。制造商根据需要**了各种荧光标记的抗体。在选择时，首先要满足的是，所选的抗体必须能够在流式上进行检测。各单位购买的流式···

　　一、荧光标记选择指南。

　　流式检测的**步是选择哪种方法，通常是用荧光物质标记的抗体。制造商根据需要**了各种荧光标记的抗体。在选择时，首先要满足的是，所选的抗体必须能够在流式上进行检测。各单位购买的流式仪器功能不完全一致。首先，联系检测方查看是否可以检测。在附表中，我给出了常用荧光标记物质的刺激波长和检测波长，可供参考。有几个原则可以一起说：

　　1.流体检测时，首先推出直接标记荧光物质的抗体。如果没有直接标记的抗体，也可以间接发送，即在二抗上标记荧光分子。然而，这增加了处理的难度和步骤，往往不同程度地影响检测结果。

　　2.厂家推出的一些抗体明确表示适合流式检测，而另一些则表示适合免疫组化。前者是**，可以保证质量和数量，但后者不是不可用的。一般来说，如果没有明确表示适合流式检测的抗体，也可以使用后者，但需要注意的是，检测结果不一定很理想。

　　3.单抗和多抗均可应用。

　　4.绿色荧光蛋白等荧光物质在检测过程中会占据荧光通道。我也遇到过几次有人用FITC标记的抗体检测目标蛋白，然后转移绿色荧光蛋白的细胞(据说有人用这种方法得到了满意的结果!)，难道不知道绿色荧光蛋白和FITC是荧光通道，更别说一起检测了。

　　5.如果检测*巴细胞等细胞，经常同时标记各种抗体，选择时不要选择错误。我自己更喜欢多重标记，因为它可以减少抗体和细胞的用量，特别是对于小鼠的血液标本，采集的血液量很少，使用多重标记更有利。当然，这要求流动操作员具有较高的水平，并注意调整流动仪器的各种参数。

　　二、免疫荧光单标记和双标记的方法。

　　1.免疫荧光单标记法。

　　免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法相对简单，只要按照染色步骤，通常没有太多问题。但要注意固定液的选择，固定液的选择是否合适，可能会直接影响染色结果。具体的染色方法如下。

　　1)所需材料和试剂。

　　(1)在盖玻片或玻璃培养皿中培养60%-70%的细胞。

　　(2)一抗.FITC或TRITC标记的二抗。

　　(3)4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液(120℃预冷20min)。

　　(4)封闭液。

　　(5)0.01mol/LPBS缓冲液。

　　2)染色方法。

　　(1)用0.01MPBS片或glass-botom培养皿，用0.01MPBS洗2-3次。

　　(2)TritonTritonX-100，37℃，30rain。

　　(3)加入4%多聚甲醛室温固定30min或4℃冷丙酮固定10min。

　　(4)正常阻断血清1:20封闭室温20~30min，**Igg的非特异性结合。阻断血清必须与二抗相同的正常血清。

　　(5)去除正常血清，直接加入一抗，37C孵化1h或4℃过夜。抗体稀释为0.01mol/LPBS(理想抗体浓度需要测试)。

　　(6)0.3%TritonX-100洗5min，0.01mol/IPBS洗5min，0.3%TritonX5min，0.01mpBS洗5min。

　　(7)加入FITC-二抗或TRITC-二抗，37℃孵化1h。

　　(8)0.3%TritonX-100洗5rain，0.01mol/LPBS洗5min，0.3%TritonX5min，0.01mol/LPBS洗5mln，用滤纸吸干。

　　(9)90%甘油(PBS制备)封片。

　　(10)观察激光扫描共焦显微镜或4℃避光。

　　2.免疫荧光双标记法。

　　免疫荧光的双重标记是指当怀疑某个配体与已知受体结合时，同时标记细胞中的两种蛋白质分子。这种方法有点复杂。首先，我们应该注意的是，所使用的抗体必须是来自不同种类动物的两种特异性抗体(例如，A抗体是多克隆抗体，来自兔子;B抗体是单克隆抗体，来自小鼠)。其次，两种二抗所带荧光素的发射光不应重叠并尽可能远离。通常可以选择FITC和TRITC。Alex488和TRITC。FITC和Cy5，或Cy3和Cy5。通常，染色时，两种一抗可以同时孵化，然后两种二抗可以同时孵化。然而，当染色结果中的一种颜色非常弱，而另一种颜色相对较强时，应考虑孵化颜色较弱的二抗。其他步骤也用免疫荧光单标记。

　　三、样品制备注意事项。

　　(1)免疫荧光标记时，如果样品来源为组织，应采用冷冻切片。

　　(2)样品制备应满足一般荧光显微镜观察的要求。

　　(3)尽量去除非特异性荧光信号。细胞在荧光染色后可能会产生自发荧光，可以用PBS代替一抗作为比较，以区分自发荧光和阳性结果。

　　(4)为了不压扁细胞，用甘油和PBS混合物(9:1)密封玻片与载玻片之间的介质，甘油具有抗荧光淬灭的作用。同时，密封时要注意避免气泡。

　　(5)用指甲油密封盖玻片周围，避免压扁细胞。

　　(6)为防止荧光淬灭，可在介质中加入抗氧化剂DABCO(100mg/mi)，室温密封6个月;或苯二胺(100mg/mi)，-20℃，2~3周。

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