各类荧光染料外泌体示踪的介绍

本文摘要：细胞能分泌各种各样不一样类型的细胞外囊泡，如凋亡小体.自噬体.微囊泡和外泌体等。在其中，外泌体来源于细胞中的早期内体，初期内体先后进化成晚期内体和多囊泡体，随后与细胞膜融合，将外泌体释放到细胞外部[1···

　　细胞能分泌各种各样不一样类型的细胞外囊泡，如凋亡小体.自噬体.微囊泡和外泌体等。在其中，外泌体来源于细胞中的早期内体，初期内体先后进化成晚期内体和多囊泡体，随后与细胞膜融合，将外泌体释放到细胞外部[1]。外泌体直径约30-150nm，具备类似细胞膜的脂类双分子结构，膜上带有多种多样四跨膜蛋白和脂类，其內部还带有多种多样核酸和蛋白。外泌体普遍存有于细胞培养液及各种各样体液，参加细胞间的沟通交流.物质运送.细胞稳态的保持和炎症调节等[2]。

　　外泌体作为纳米级颗粒，在观察外泌体在体内和体外的痕迹以及研究其在生理.病理过程中的作用之前，需要进行标示痕迹处理。外泌体标示痕迹的方法根据介质的不同，分为荧光染料.荧光蛋白.荧光素酶和物理标志法，这些标示法可选择性地标示在外泌体的外膜.内膜或内膜。例如，排水师染料.PKH染料.渗透性染料等等。

　　羰花青染料

　　排水染料属于亲脂染料，通常用于染料细胞膜和其他脂溶性生物结构，可以嵌入外部分泌物的膜，而不是共同价格。进入双层脂膜后，它可以扩散到周围，达到**浓度，可以染色整个细胞膜，使整个膜结构的外部分泌物完全标记。常用的资深染料包括DIII、DIO、DID、DIR等。将DIR标记的骨髓间充质干细胞分泌物注入脊髓损伤大鼠[5](图3)M2巨噬细胞。其中DIR(青色)标记外泌物体，INOS(红色)是M1巨噬细胞标记物，CD206(绿色)是M2巨噬细胞标记物的DAPI(蓝色)再染料。

　　PKH染料

　　PKH染料(Paulkarlhoran**的染料)也属于亲脂染料，不同于COPT染料，PKH染料分子有较长的脂肪族尾巴，可插入脂质双分子层，而在脂质双分子层外部的荧光基团稳定地与细胞膜脂质区域结合并发出荧光。PKH-67和PKH-26是通常用于外泌体标记的PKH染料。图4显示了神经干细胞来源的外泌体(EXOS)，这是PKH-26标记的神经干细胞来源。研究发现，它可以调节神经的发生。在实验中，在体外分化条件下，通过PKH26标记的神经干细胞分泌的外泌体(EXOS)和体细胞诱导分化的干细胞(INPCS)分别与成人大脑神经干细胞(NPCS)培养了7天(图4a)，通过PKH26标记的外泌体被NPCS的摄入(图4b)进一步验证了两种外泌体对神经元分化的影响。结果结果表明，EXOS可以显著增加神经元细胞的比例(图4c)，而胶质细胞在各组中没有显著差异[6]。

　　渗透型染料

　　渗透染料可穿过外泌体的膜结构，进入外泌体内。常用的有羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯(CFSE)和钙黄绿素乙酰甲酯。

　　CFSE可以被动地扩散到细胞中，没有颜色和自发的荧光，直到其醋酸盐基团被细胞内的酯酶去除，然后产生羧基荧光素琥珀亚胺酯，可以发出明亮的荧光素。后者可与细胞内的氨基发生反应，形成一种荧光偶联物，可以用醛固定剂稳定地固定。图5显示了使用CFSE标记的小鼠肺上皮细胞外泌体，并与小鼠骨髓干细胞及其分化的红细胞(Ter119+)一起培养颗粒细胞(GR-1+)和B细胞，发现小鼠骨髓细胞可以摄入肺上皮细胞外泌体[7]。

　　钙黄绿素乙酰甲酯是在传统式的Calcein(钙黄绿素)基本上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基，提升了疏水性，使其可以非常容易渗入活细胞膜。一旦进到细胞后，Calcein-AM(自身不发光)被细胞内的酯酶剪裁，产生膜非渗透性的极性分子Calcein，进而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。根据钙黄绿素染色的方式能够对外泌体整体性开展检测。假如外泌体整体性较好，发射绿色荧光的钙黄绿素能够保存在外泌体中，相反，则会从外泌体中泄漏出来[8]。

　　除此之外，也有一些别的染料能够标出外泌体，例如CY3.R18等。不一样的标出方法特性差别很大。用荧光染料标出外泌体简易操作，但一些荧光染料只适用于来源于条件培养或体液提纯的外泌体，不可以染色原始细胞内的外泌体并追踪其在细胞间的运动。因而，在开展外泌体的标出标出时，必须依据研究目的，依据不一样标出方式的特性开展合理挑选。

　　

　　参考文献

　　[1]EMANUELIC、SHEARNAI、ANGDELI.GDAL。2015、71:24-30，EMMANUELIC、SHEARNAI。

　　[2]Hesviknp，Llorenteneal.Curentknowegexososesisandrease[J]Cellmolesci,2018,75(2)

　　[3]Amamadef、Mariadetal.Exosomebiogesis,bioctitisandes,bioctititisancesances(1):328-3334。

　　[4]刘朝阳、王炜、李文博、胡雅茹、张岱、任伟红。研究了现代免疫学现状[J]，2020,40(03):240-244

　　[5]KLalkkfortartargetay..Intravesexorexorexorestargetmetmell(1)

　　[6]May.etal.exsomesseas.exmeseaseasedfroalprogensanduralprogugmiR21a.2019Aug(17)：96.

　　[7]etal，JasonM。

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