荧光染料基础知识概括，快来学习！

本文摘要：1FITC和TRITC。异硫氰酸荧光素(FITC)是一种有机荧光染料，目前仍用于免疫荧光和流式细胞手术。在495/517495/517nm处，染料会产生激发/发射峰值，并可与不同的抗体与异硫氰酸盐反应···

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　　FITC和TRITC。

　　异硫氰酸荧光素(FITC)是一种有机荧光染料，目前仍用于免疫荧光和流式细胞手术。在495/517495/517nm处，染料会产生激发/发射峰值，并可与不同的抗体与异硫氰酸盐反应基团结合，该基团可与氨基团结合。

　　其基本成分-荧光素，其摩尔质量为332g/mol，常用作荧光示踪剂。用于荧光显微镜技术的**批染料Fitc(389g/mol)，并将其视为Alexafluor?后续荧光染料的发端，如488。染料的荧光活性取决于其大共轭芳香电子系统，该系统受到蓝色光谱中光的刺激。

　　TRITC[四甲基罗丹明-5(6)-异硫氰酸C[四甲基罗丹明-5(6)-异硫氰酸]。与FITC相反，TRITC不是荧光素，而是罗丹明家族的衍生物。正是这个系统导致了他们的荧光行为，罗丹明也有一个大的共轭芳香电子系统。

　　与FITC相反，TRITC(479g/mol)是由**波长为550nm的绿色光谱中的光激发的，其**发射波长为573nm。基于异硫氰酸盐反应基团，与蛋白质(例如，抗体)结合。

　　虽然FITC和TRITC仍在使用，但在*新的显微镜技术中并不推荐它们，因为它们是发光相对较弱的荧光染料，其优点只是经济效益。

　　图1：果蝇胚胎发育，绿色：FITC;红色：TRITC。

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　　青色素

　　这种荧光染料相对较少，来源于青色素，也是其名称的由来:Cy2.Cy3.Cy5和Cy7。通过其反应基团，上述所有青色素都可以与核酸或蛋白质连接。例如，使用蛋白质标记的马来酰亚胺基团。有趣的是，Cy5对周围的电子环境非常敏感，可以用于酶测定。

　　附着蛋白质的构象变化会导致荧光发射的阳性或阴性变化。此外，cy3和cy5也可用于fret测试。青色素染料是一种相对较老的荧光染料，但它是提高其他荧光染料亮度、耐光性和量子产量的基础。

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　　染料：Alexafluor。

　　Alexafluor?染料是一种荧光染料系列，具有负电荷和亲水性，其染料种类繁多，常用于荧光显微镜技术。

　　这些染料的名称是以其**者RichexHaugland的名字命名的。该产品的标识是Molecularprobes(LifeTechnogies的子公司，注:2014年2月，LifeTechnogies被Thermofisher收购)。此外，这些产品标识还涵盖了相应的激光激发波长。

　　例如，Alexafluor，具有广泛的应用范围和**的激发波长为493nm，488，可以通过标准的488nm激光激发。Alexafluor?488的**发射波长为519nm，正是因为具有上述特征，使Alexafluor?488与FITC的属性相似。

　　虽然Alexafluor?488是一种荧光素衍生物，但与FITC相比，它具有更好的稳定性和荧光亮度，而且pH敏感度较低。所有的Alexafluor?染料(例如，Alexafluor?546.Alexafluor?633)是不同基础荧光物质的磺化形式，如荧光素。

　　图2：小鼠转基因胚胎。肢体节，E10.5小鼠转基因胚胎的5个肢体节：Epaxialmyf5eGFP;GFP-Alexa488免疫组化染色;用desmin-Cy3染色胚胎肌肉纤维，用Hoechstsstste自上而下揭示细胞核：3.5mma，800μm(b)。图片来源：Aurieliessouchesouchesouchechechechechen。

　　图3：小鼠成纤维细胞，绿色：F-Actin，FITC;红色：Tubulin，Cy5;蓝色：细胞核，DAPI。图片来源：德国海德尔堡·马克斯-普朗克研究所。

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　　DNA染色

　　在荧光显微镜技术中，核酸不仅对蛋白质结构进行了研究，而且具有重要的研究意义。有时，细胞的**位置和数量必须通过检测细胞核来确定。*常用的DNA染色剂是DAPI(4'，6-2-2-苯基吲哚)，可以与DNA双螺旋的A-T富集区域结合。如果DAPI附着在DNA上，其荧光强度将高于游离状态。这种染色剂受到紫外光的刺激，**波长为358nm，发射光谱非常宽，达到461nm的峰值。此外，还可以检测弱荧光的RNA组合。在这种情况下，发射波长将转移到500nm。有趣的是，DAPI可以穿透整个细胞膜。因此，它可以用于固定和活细胞。

　　第二种广泛使用的DNA染料是Hoechst染料系列，这些染料*初是由Hoechstag化学公司生产的。Hoechst333342和Hoechst34580都是双苯酰亚胺，可以嵌入A-T富集区域，所以这一系列的染料很少使用。与DAPI类似，这三种染料都可以受到紫外光的刺激，**发射波长为455nm，而未结合的染料**发射波长在510-540nm之间。Hoechst染料也具有细胞渗透性，因此可用于活细胞或固定细胞。这种染料与DAPI的区别在于它们毒性较低。

　　碘化丙啶是一种DNA染色剂，不能通过细胞膜。由于上述特性，染料不能进入完整的细胞，因此染料通常用于区分细胞群中的活细胞和死细胞。此外，碘化丙啶也是一种嵌入剂，但对于不同的碱基没有结合差异。染料与核酸结合后，**刺激波长为538nm，**发射波长为617nm。**刺激和发射波长和光强不结合PI会更低。PI还可以在不改变自身荧光特性的情况下与RNA结合。有时需要使用适当的核酸酶来区分DNA和RNA。

　　不需要早期治疗，吖啶橙可以识别DNA和RNA。吖啶橙与DNA结合后，**激发/发射波长为502nm/525nm，与RNA结合后，**激发/发射波长为460nm/650nm。此外，它还可以进入酸性区域，如溶酶体。在这里，阳离子染料被质子化。在这种酸性环境中，吖啶橙是由蓝光谱中的光激发的，但发射波长在橙色区域**。因为凋亡细胞有大量被吞噬的酸性区域，所以吖啶橙常被用作这类细胞的标记物。

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　　本文由QiyueLh整理，2022年6月15

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