11类流式细胞学荧光染料，你都知道吗？

本文摘要：流式细胞学*重要的促进力是抗体，其次是与仪器检测能力相匹配的荧光染料。荧光染料仍然跟不上仪器检测通道的数量。现有的流式荧光染料可分为以下11类：1.有机小分子。提到有机小分子，大多数人肯定是一头雾水，···

　　流式细胞学*重要的促进力是抗体，其次是与仪器检测能力相匹配的荧光染料。荧光染料仍然跟不上仪器检测通道的数量。

　　现有的流式荧光染料可分为以下11类：

　　1.有机小分子。

　　提到有机小分子，大多数人肯定是一头雾水，但如果我举几个例子，肯定会恍然大悟。

　　FITC(分子量39da),Alexafluor488(FITC类似物,分子量643da),Texasred(Txred,分子量6222da),Alexafluor647(分子量1155da),Pacificblue(分子量242da)和Cy5(分子量762da)。基本上是否使用?

　　这些有机小分子具有一致的发射光谱和较小的斯托克斯位移(激发波长和发射波长之间的差值约为50-100nm)，光稳定性好，容易与抗体偶联，因此得到了广泛的应用。

　　值得注意的是，Alexafluor染料光稳定性优于FITC，所以如果要制作成像，可以选择它们。

　　2.藻胆蛋白。

　　海藻胆蛋白是从蓝藻类和鞭毛藻类中提取的一种大蛋白分子。例如，海藻红蛋白(PE)的分子量为240000da。这些蛋白质具有较大的斯托克斯位移(75-200nm)和稳定的发射光谱。由于海藻胆蛋白较大，在结合过程中通常具有1:1的蛋白质与荧光染料的比例，因此对定量流式细胞非常有用。

　　但是，藻胆蛋白容易被光引起漂白，因此不建议长时间或反复暴露在激发光源中。

　　除了胆蛋白家族中，除了海藻红蛋白(PE)外，还有其他海藻蓝蛋白(APC)和苦瓜叶绿素蛋白(PerCP)。

　　3.量子点

　　量子点(Qdots)是一种具有荧光发射光谱的半导体纳米晶体，与纳米晶体的大小密切相关。它们*适合被紫外线或紫光激发，但也容易被其他激光激发。因此，在多参数实验中使用Qdots时，其他波长激光器的这种微小激发会使荧光补偿复杂化。

　　这就是为什么，尽管量子点染料的亮度很高，但这些试剂大多被聚合物染料取代，因为这些补偿问题难以解决，并且很难将qdot与抗体结合。

　　4.高分子染料。

　　聚合物(聚合物)染料由收集光信号的聚合物链组成。根据聚合物链的长度和连接的分子亚基，可以调节吸收和发射特定波长的光。这些染料非常稳定，其量子效率与藻胆蛋白相似，大大提高了光稳定性。

　　因为聚合物染料只能吸收特定波长的光，所以避免了Qdots存在的跨波长刺激问题。

　　高分子染料的典型代表是Briliantviolet(Brviolet)。

　　5.串联染料。

　　与有机小分子荧光染料(Cy3、Cy5、Cy7)化学偶联，串联染料将藻胆蛋白(PE、APC、PerCP)或高分子染料(BV421、BUV395)串联，形成单激光激发更多波长的发射光。

　　例如，Texasred的**激发是589nm，而PE的发射是585nm，所以通过将PE与Texasred耦合，PE的发射光通过FRET激发Texasred，从而使PE-Txred可以用488nm或532nm的激光激发。

　　同样的方法也可以用来串联有机小分子染料。

　　串联染料非常明亮，具有较大的斯托克斯位移值(150-300nm)，对于检测低密度抗原非常有用。但串联染料的稳定性不如供体荧光染料，能量转移效率因批次而异，使补偿复杂化。

　　6.重金属离子。

　　严格地说，重金属离子不是荧光素，但我们也在这里提到。

　　用于质谱流式的抗体不是与荧光素结合，而是与镧系元素系列中的单个同位素重金属离子结合。目前，商业上有35种镧系元素同位素可用于抗体偶联。这些探测器是非荧光的，仅用于质谱流式分析。

　　7.荧光蛋白。

　　荧光蛋白经常被用作基因表达的报告系统。*常用的绿色荧光蛋白(GFP)来自维多利亚水母(Aequoreavictoria)。

　　来自蘑菇海葵Discosoma的红色荧光蛋白(Dsred)，从Dsred衍生出下一代单体荧光蛋白(mchery，mbananana)，具有更广泛的激发和发射光谱。

　　随着基因克隆技术的成熟，目前已有数百种荧光蛋白，其激发和发射光谱范围从紫外线到近红外线。

　　8.核酸染料。

　　核酸染料结合DNA。RNA或两者都结合在一起。它们可以用于定量DNA进行细胞周期分析(例如PI、7-AAD、Dycleviolet、DAPI)，分选染色体(例如Hoescht33342、ChromomycinA3)，用于分选干细胞(例如Hoescht333342)。

　　结合使用核酸染料和另一种标记物(如荧光染料偶联的抗溴脱氧尿苷(BrdU))，可以确定增殖水平。

　　细胞增殖染料。

　　细胞增殖可以通过将细胞与细胞DNA合成过程混合，然后用抗体和DNA染料对BRDU进行染色来测量。然而，这种方法不适合长期增殖研究。

　　羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)可用于跟踪增殖细胞的多次分裂。现在已经有了CFSE染料的红色和紫色变种。这些染料适用于长期增殖研究，在适当浓度下不影响细胞生长或形态。

　　10.细胞死活染料。

　　通过结合染料和细胞内胺类物质，可以通过排除性染料(例如碘化丙啶。DAPI)来确定细胞活力。

　　排除性染料不能固定，只适用于无感染、需要立即分析的细胞。

　　胺类染料包括Live/dead(thermofisher)、Zombie(biolegend)或Fixaleabliablity)，适用于固定细胞，因此适用于具有传染性细胞。

　　11.钙指示剂染料。

　　钙指示剂染料与钙结合后会发生色移，可用于指示细胞激活和信号传导。

　　*常用的染料仍然是indo-1，即紫外双相钙探针。此外，还有fluo-3的blue-greenciumprobes。

　　文献来源：Current Protocols in Immunology，Chapter 5.1.4, Flow Cytometry: An Overview

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