荧光蛋白标记技术的原理是什么？

本文摘要：荧光蛋白标记技术蛋白质标记的主要目的是监测生物过程、辅助检测(如化合物的可靠量化、蛋白质修饰的特异性检测)或纯化标记的蛋白质及其结合物。蛋白质标记可以提高检测灵敏度，简化检测流程。目前，有多种蛋白质标···

　　荧光蛋白标记技术

　　蛋白质标记的主要目的是监测生物过程、辅助检测(如化合物的可靠量化、蛋白质修饰的特异性检测)或纯化标记的蛋白质及其结合物。蛋白质标记可以提高检测灵敏度，简化检测流程。

　　目前，有多种蛋白质标记技术可以帮助我们研究活细胞中蛋白质的丰度、位置、相互作用、翻译后修饰、功能甚至监测蛋白质的运输。目前，有许多类型的标记和标记方法可供选择，但应根据具体应用选择合适的标记策略。

　　NO.1代谢标记策略

　　代谢标记策略是一种体内标记方法，在这种方法中，用化学标记的营养素“喂养”细胞，然后将这些营养素结合到新合成的蛋白质、核酸或代谢物中。然后我们可以收集细胞并分离这些分子，以获得细胞生物过程的全局视图。

　　蛋白质同位素标记

　　原理：蛋白质同位素标记是一种经典的蛋白质追踪和蛋白质组定量技术。用天然同位素(轻)或稳定同位素(重)标记的必需氨基酸替代细胞培养基中相应的氨基酸，从而在细胞生长过程中通过添加含有不同同位素的氨基酸来标记细胞新合成的蛋白质。

　　应用实例：SILAC(细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记)是蛋白质组学研究中一种流行的代谢标记方法，即细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记。结合质谱分析，SILAC通过用重氨基酸(例如15N或13C赖氨酸)标记一组培养物或细胞系，并向另一组添加正常的轻氨基酸，来量化两种培养物或细胞系之间蛋白质丰度的差异。然后，根据细胞数量或蛋白质量的比例，将在两种条件下生长的细胞的裂解蛋白混合。分离纯化后，用质谱进行鉴定。根据一级质谱中两种同位素肽的面积比较，得到了两种条件下蛋白质丰度差异的相对评价。

　　蛋白质代谢的其他标志物

　　原理：如果没有质谱实验条件，可以使用基于生物正交反应的代谢标记方法。在双正交系统中，细胞被分子结构单元“喂养”，其中一些化学基团与自然生物反应基团不发生反应。添加含有该基团的反应伙伴的外源化合物以启动化学反应，将标记的生物分子偶联到所需的官能团。

　　应用实例：用含有叠氮基团的结构单元“喂养”细胞，然后在实验后用含有磷化物h基团的试剂处理。叠氮化物和-pH2基团通过Staudinger连接反应偶联。叠氮化物和膦基团通常不存在于生物系统中，因此这些分子是惰性的。

　　No.2荧光标记策略

　　自发荧光蛋白、小分子荧光标记染料、纳米晶材料(即量子点材料)、小分子蛋白标签等可作为荧光标记。结合荧光成像检测仪，可以研究靶蛋白的表达、在细胞中的定位、相互作用、活性等指标。

　　荧光蛋白标签

　　如果目标蛋白与荧光蛋白融合，就可以实现对目标蛋白的细胞内观察。它可以用于多色标记和荧光共振能量转移(FRET)应用，可视化蛋白质与其他亚细胞结构的易位，研究蛋白质-蛋白质共定位，检测不同启动子的基因表达开始，以及分离混合细胞群。从绿色荧光蛋白GFP的早期发展到现在，我们已经有了涵盖多种光谱领域的荧光蛋白，包括绿色荧光蛋白、蓝色和蓝绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白和红色荧光蛋白。不同光谱类型的荧光蛋白在亮度、光稳定性和分子大小上存在差异。

　　体外荧光染料标记蛋白质

　　荧光染料标记蛋白质或多肽技术是一种常用的体外蛋白质标记技术。除了GFP和其他fusion express

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