本文摘要：吲哚菁绿ICG-Sulfo-Osu吲哚菁绿(ICG)是一种用于医学诊断的花青染料。它用于确定心输出量，肝功能和肝血流量，以及用于眼科血管造影。它具有接近800nm的峰值光谱吸收。这些红外线能穿透视网膜···

吲哚菁绿ICG-Sulfo-Osu

　　吲哚菁绿(ICG)是一种用于医学诊断的花青染料。它用于确定心输出量，肝功能和肝血流量，以及用于眼科血管造影。它具有接近800nm的峰值光谱吸收。这些红外线能穿透视网膜层，使ICG血管造影成像比荧光血管造影更深的循环模式。ICG的半衰期为150至180秒，仅通过肝脏从胆汁液中排出。*近的一项研究表明ICG在注射后20分钟内靶向动脉粥样硬化，并提供足够的信号增强，用于动脉粥样硬化兔子体内的脂质，发炎，冠状动脉大小的斑块的检测。离体荧光反射成像显示，与注射生理盐水的动脉粥样硬化兔相比，注射ICG的动脉粥样硬化兔的斑块靶 - 背景比高。氨基反应性ICG衍生物用于与抗体和其他生物分子制备ICG生物缀合物。所有ICG染料都需要溶解在DMSO中。

　　注意：该标记方案是针对山羊抗小鼠IgG与ICG的缀合物**的。

　　1.准备蛋白质储备溶液(溶液A)：

　　将100L反应缓冲液(例如，1M碳酸钠溶液或1M磷酸盐缓冲液，pH~9.0)与900L目标蛋白质溶液(例如抗体，蛋白质浓度> 2mg / ml，)混合，得到1 mL蛋白标记储备液。

　　注意1：蛋白质溶液(溶液A)的pH值应为8.5±0.5。 如果蛋白质溶液的pH低于8.0，则需使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至8.0-9.0的范围。

　　注意2：蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐(例如硫酸铵和乙酸铵)。

　　注意3：牛血清白蛋白(BSA)、明胶稳定不纯的抗体等标记的效果不理想。 叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。 可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞，以获得**标记结果。

　　注意4：如果蛋白质浓度低于2 mg / mL，则结合效率明显降低。 为获得**标记效率，建议*终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。

　　2.准备染料储备溶液(溶液B)：

　　将无水DMSO加入到ICG染料小瓶中以制备10-20mM储备溶液。 通过移液或涡旋混合均匀。

　　注意：在开始缀合之前准备染料储备溶液(溶液B)，现配现用，保持溶液新鲜。 染料储备溶液的长期储存可降低染料活性。 溶液B可以在不受光照和潮湿的情况下储存在冰箱中两周。 避免冻融循环。

　　3.确定**染料/蛋白质比例(可选)：

　　注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。我们建议您通过使用连续不同量的标记染料溶液重复步骤4和5来实验确定**染料/蛋白质比率。通常，对于大多数染料 - 蛋白质缀合物，推荐使用4-6种染料/蛋白质。

　　3.1使用10：1摩尔比的溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)作为起点：将5μl染料储备溶液(溶液B，假设染料储备溶液为10 mM)加入到样品瓶中，蛋白质溶液(95μl溶液A)。假设蛋白质浓度为10mg / mL并且蛋白质的分子量为~200KD，蛋白质的浓度为~0.05mM。

　　注意：蛋白质溶液中DMSO的浓度应<10%。

　　3.2运行结合反应(见下面的步骤4)。

　　3.3重复#3.2，溶液B /溶液A的摩尔比为5：1;分别为15：1和20：1。

　　3.4使用预制的旋转柱纯化所需的缀合物。

　　3.5计算上述4种结合物的染料/蛋白质比例(DOS)。

　　3.6运行上述4种缀合物的功能检测，确定**的染料/蛋白质比例，以扩大标记反应。

　　4.运行缀合反应：

　　4.1在有效摇动下，将适量的染料储备溶液(溶液B)加入到蛋白质溶液(溶液A)的小瓶中。

　　注意：溶液B /溶液的**摩尔比由步骤3.6确定。 如果跳过步骤3，我们建议使用10：1摩尔比的溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)。

　　4.2继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

　　5.纯化缀合物

　　以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料 - 蛋白质缀合物的实例。

　　5.1按照制造说明准备Sephadex G-25色谱柱。

　　5.2将反应混合物(直接来自步骤4)加载到Sephadex G-25柱的顶部。

　　5.3样品在顶部树脂表面下方运行时，加入PBS(pH 7.2-7.4)。

　　5.4将更多PBS(pH 7.2-7.4)加入所需样品中以完成柱纯化。

　　注意1：对于立即使用时，染料 - 蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并等分多次使用。

　　注意2：对于长期储存，染料 - 蛋白质缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

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